Konfokal mikroskop. Korneanın konfokal intravital mikroskopisi. Z serisi ve 3D görüntüler

Giriiş.

Konfokal bir mikroskop, "klasik" bir optik mikroskoptan (bkz.) Farklıdır; çünkü her an, bir nesnenin bir noktasının görüntüsünün kaydedilmesi ve tarama yoluyla (örneği hareket ettirmek veya optik sistemi yeniden düzenlemek) tam bir görüntü oluşturulur. . Yalnızca bir noktadan gelen ışığı kaydedebilmek için objektif merceğin arkasına, analiz edilen noktanın yaydığı ışık (kırmızı ışınlar) yansıyacak şekilde küçük bir diyafram yerleştirilir. pirinç. 1b), diyaframdan geçerek kayıt altına alınır ve geri kalan noktalardan gelen ışık (örneğin, üzerindeki mavi ışınlar) pirinç. 1b) esas olarak diyafram tarafından bloke edilir. İkinci özellik ise aydınlatıcının görüş alanında tekdüze bir aydınlatma yaratmaması, ışığı analiz edilen noktaya odaklamasıdır. (Şekil 1c). Bu, numunenin arkasına ikinci bir odaklama sistemi yerleştirilerek sağlanabilir ancak bu, numunenin şeffaf olmasını gerektirir. Ayrıca objektif lensler genellikle nispeten pahalı olduğundan aydınlatma için ikinci bir odaklama sisteminin kullanılmasının pek faydası yoktur. Bir alternatif, hem gelen hem de yansıyan ışığın tek bir mercek tarafından odaklanmasını sağlayacak şekilde bir ışın ayırıcı kullanmaktır. (Şekil 1d). Bu şema aynı zamanda ayarlamayı da kolaylaştırır.

Pirinç. 1 A. Numunenin çeşitli noktalarından gelen ışık fotodetektöre girdiğinde geleneksel bir optik mikroskopta ışınların yolu.

Pirinç. 1b. Diyaframın kullanılması, analiz edilen alanın dışındaki numune noktalarından gelen arka plan aydınlatmasını önemli ölçüde azaltabilir.

Pirinç. 1. yüzyıl Işığı analiz edilen noktaya odaklayan bir arka ışık kullanılarak kontrastta ek bir artış elde edilir.

Pirinç. 1 yıl Işın ayırıcı tasarımı, çift lens kullanarak mikroskop tasarımını ve hizalama işlemini basitleştirir
(yansıyan sinyalin aydınlatılması ve toplanması için).

Konfokal mikroskopta çözünürlük ve kontrast.

Şimdi eş odaklı mikroskopi kullanıldığında kontrastın nasıl ve ne kadar niceliksel olarak değiştiğini matematiksel olarak ele alalım. İlk olarak, o zamandan beri eş odaklı mikroskopışık mercekten iki kez geçtiğinde, nokta bulanıklaştırma işlevi (bundan sonra PSF olarak anılacaktır, tanıma bakınız) şu şekildedir:

Niteliksel bir anlayış için, her bir PSF'yi, bir fotonun koordinatları olan bir noktaya çarpması veya bir fotonun koordinatları olan bir noktadan kaydedilmesi olasılığı olarak düşünmek uygundur, o zaman eş odaklı PSF bağımsız olasılıkların ürünüdür. Açık pirinç. 2 Normal bir PSF'nin ve konfokal bir PSF'nin görüntüsü gösterilmektedir.

Pirinç. 2. Konfokal PSF sağda, normal PSF ise solda gösterilir.

Çözünürlük için Rayleigh kriterini kullanırsak (maksimum dağılımdan %26'lık düşüş), eş odaklı bir mikroskopta çözünürlüğün arttığını ancak önemli ölçüde olmadığını görürüz. Konfokal mikroskop için

geleneksel bir mikroskop için ise

Bununla birlikte, eş odaklı bir mikroskobun temel avantajı Rayleigh kriteri anlamında çözünürlükte bir artış değil, kontrastta önemli bir artıştır. Özellikle, odak düzlemindeki geleneksel bir PSF için, birinci yanal maksimumdaki genliğin merkezdeki genliğe oranı %2'dir; konfokal mikroskop durumunda bu oran %0,04 olacaktır. Açık pirinç. 3 Bunun önemli olduğu yerde pratik bir örnek verilmiştir. Şeklin üst kısmında loş bir nesnenin (yoğunluğu parlak olanınkinden 200 kat daha azdır) geleneksel bir mikroskopla tespit edilemediğini görüyoruz, ancak nesneler arasındaki mesafe Rayleigh tarafından öngörülenden önemli ölçüde daha fazla. kriter. Aynı zamanda bu nesnenin eş odaklı bir mikroskopta iyi bir şekilde kaydedilmesi gerekmektedir (Şekil 3'ün alt kısmı).

Pirinç. 3. Geleneksel bir mikroskop (üstteki resim) ve eş odaklı bir mikroskop (alttaki resim) durumu için yoğunluk dağılımı.
Loş bir nesnenin maksimum yoğunluğu, parlak bir nesnenin yoğunluğundan 200 kat daha azdır. 1 ].

Konfokal bir mikroskop için optik eksen boyunca yoğunluk dağılımı şu ifadeyle belirlenir:

Daha sonra Rayleigh kriterini kullanarak optik eksen boyunca çözünürlüğü elde ederiz.

Burada optik eksen boyunca çözünürlüğün geleneksel bir mikroskoptaki odak derinliği ile karıştırılmaması gerektiğini belirtmek önemlidir. Tipik olarak odak derinliği, optik eksen boyunca çözünürlükten yüzlerce kat daha fazladır.

Odak düzleminde açıklığın etkisi.

Yukarıda verilen açıklamada hiçbir şekilde yer almayan parametrelerden biri ışınlayıcı ve toplayıcı merceklerin odak düzlemindeki açıklıkların boyutudur. Analiz sırasında kaynağın bir nokta kaynak olduğunu zımnen varsaydığımızı ve bu varsayım altında geleneksel ve eş odaklı bir mikroskop için nokta bulanıklık fonksiyonunu (PSF) elde ettiğimizi unutmayın. Ortaya çıkan PSF'ler objektif merceğin özelliklerini tanımlar ve diyaframın nesne düzlemindeki görüntüsü, fotodetektör tarafından hangi alanlardan kaydedildiğini belirler. Ancak açıklık boyutunun azaltılmasının iletilen ışık miktarını azalttığı, gürültü seviyelerini artırdığı ve sonuçta elde edilen kontrast kazanımlarını ortadan kaldırabileceği açıktır. Bu nedenle, en uygun açıklık boyutu seçimi ve makul bir uzlaşma sorusu ortaya çıkıyor.

Airy noktasından daha küçük bir açıklığa sahip bir açıklık, yalnızca yoğunluk kaybına neden olur ve çözünürlük üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Bir Airy spotun açıklık boyutu, objektif merceğin çözme gücünün maksimum düzeyde kullanılmasına olanak tanır. Ancak Airy spotun yaklaşık 3-5 katı açıklık boyutu en uygun uzlaşma gibi görünmektedir. Burada tartışılan boyutun, nesne düzlemindeki görüntünün boyutunu ifade ettiği ve dolayısıyla açıklık deliğinin gerçek boyutunun merceğin büyütülmesine bağlı olduğu anlaşılmalıdır. Spesifik olarak, 100x lens kullanıldığında, 1 mm açıklığa sahip bir açıklık, nesne düzlemine 10 µm yarıçaplı bir daireye yansıtılacaktır.

Diyaframın varlığını matematiksel olarak hesaba katmak ve yeni bir yoğunluk dağılım fonksiyonu oluşturmak için evrişim gerçekleştirilmelidir.

ve eş odaklı bir mikroskop için, önceden elde edilen fonksiyonu ile çarpın. 5 Havadar nokta boyutunda bir açıklık durumunda ortaya çıkan yoğunluk dağılımı şekilde gösterilmiştir. pirinç. 4.

LİTERATÜR İNCELEMESİ

İntravital yansıma konfokal lazer tarama mikroskobu: yaratılış tarihi, çalışma prensibi, dermatolojide uygulama olanakları

N.N. LUKASHEVA1, S.B. TKACHENKO1, N.N. POTEKAEV2, T.S. KUZMINA1, E.A. VASILEVSKAYA1

1 Derideki onarıcı süreçlerin incelenmesi için laboratuvar, Moleküler Tıp Araştırma Enstitüsü MMA adını almıştır. ONLARA. Sechenov; 2 bölüm

cilt ve zührevi hastalıklar FPPOV MMA adını almıştır. ONLARA. Seçenov

Yaşam boyu yansıtan konfokal lazer tarama mikroskobu: kuruluş tarihi, çalışma prensibi, dermatolojide kullanım olanakları

N.N. LUKASHEVA1, S.B. TKACHENKO1, N.N. POTEKAEV2, T.S. KUZ'MINA1, E.A. VASILEVSKAYA1

1 Laboratuvar, I.M. Moleküler Tıp Araştırma Enstitüsü'nün derisindeki onarıcı süreçlerin incelenmesiyle. Sechenov Moskova Tıp Akademisi; I.M.'nin 2 FPPOP'u Sechenov Moskova Tıp Akademisi

Modern tıptaki trendlerden biri, invaziv olmayan organ koruyucu araştırma yöntemlerinin kullanılmasıdır. Bilimsel gelişmeler ve yenilikçi teknolojilerin uygulamaya konulması sayesinde, son on yılda cilt ve diğer dokuların yapısını incelemek için yeni, invazif olmayan, yüksek çözünürlüklü yöntemler ortaya çıktı. Bunlara optik koherens tomografi, yüksek frekanslı ultrason taraması, nükleer manyetik rezonans ve konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) dahildir. İkinci yöntem, epidermis ve yüzeysel dermisin görüntülerinin geleneksel ışık mikroskobuna yakın bir çözünürlükle elde edilmesine olanak tanıdığı için görüntüleme teknolojileri arasında özel bir yere sahiptir.

Konfokal mikroskopinin temel konsepti, geçen yüzyılın 50'li yıllarının ortalarında M. Minsky tarafından, önceden boyama olmadan doğal bir beyin dokusu preparasyonunda sinir ağını incelemek amacıyla geliştirildi. Bu buluş, o dönemde bir görüntü elde etmek için gerekli olan güçlü bir ışık kaynağının ve alınan bilgilerin işlenmesi için uygun bilgisayar ekipmanının bulunmaması nedeniyle fark edilmeden kaldı. 60'lı yıllarda M. Minsky'nin ardından M. Egger ve M. Petran, beyin dokusu ve ganglion hücrelerinin lekelenmemiş preparatlarını incelemek için dönen bir disk kullanan çok ışınlı bir eş odaklı mikroskop yarattılar. 1973 yılında M. Egger'in eş odaklı lazer tarama mikroskobunu daha da geliştirmeye yönelik çalışması sayesinde,

Klin Dermatol Venerol 2008;5:10-15

Bu yöntem kullanılarak elde edilen hücrelerin ayırt edilebilir görüntüleri yayınlandı. Geçtiğimiz yüzyılın 70-80'li yıllarında bilgisayar ve lazer teknolojilerinin gelişmesi ve dijital görüntü elde edilebilmesi, konfokal mikroskopiye olan ilginin artmasına neden oldu. Ve 1980'lerde, birkaç araştırmacı grubu, insan ve hayvan dokularını in vivo olarak görüntülemek için tandem taramalı eş odaklı mikroskopların kullanımını gösterdi. M. Minsky'nin patentinin süresinin dolmasından kısa bir süre sonra, eş odaklı lazer tarama mikroskobu tasarımları, birkaç araştırmacı tarafından çalışma cihazları oluşturmak için kullanıldı. Hollandalı fizikçi G.F. Brakenhoff, 1979'da C. Sheppard'ın görüntüleme teorisine yaptığı katkıyla neredeyse eş zamanlı olarak eş odaklı tarama mikroskobunu geliştirdi. T. Wilson, W. Amos ve J. White konsepti geliştirdiler ve daha sonra 1980'lerde floresan biyolojik numunelerin incelenmesinde eş odaklı görüntülemenin faydasını gösterdiler. Piyasada satılan ilk cihaz 1987'de ortaya çıktı. 1990'larda optik ve elektronikteki gelişmeler, daha güçlü ve güvenilir lazerlerin, yüksek verimli tarama aynası elemanlarının, yüksek performanslı fiber optiklerin, daha ince dielektrik kaplama katmanlarının ve dedektörlerin yaratılmasını mümkün kıldı. azaltılmış gürültü özellikleri 90'lı yılların sonlarında ortaya çıkan yüksek hızlı bilgisayar sistemleri, genişletilmiş monitörler ve büyük miktarda bilginin depolanmasına olanak tanıyan teknolojiler sayesinde, kullanılabileceği uygulama sayısı açısından CLSM'nin gelişiminde yeni bir patlayıcı aşama başladı. .

hedeflendi. İnsan derisinin in vivo görüntülenmesi için eş odaklı lazer tarama mikroskobunun kullanımına ilişkin ilk raporlar 1995'te yayınlandı. Dermatolojide kullanılan yansıma konfokal mikroskopisi M. Rajadhyaksha ve ark. tarafından geliştirilmiştir. ve "Lucid Inc" geliştirildi. 90'lı yıllarda araştırmacı grupları (S. Gonzalez ve ark.), yansımalı eş odaklı mikroskopi kullanarak derinin çeşitli patolojik durumlarını incelediler ve bu yöntemin yararlı bir teşhis aracı olarak büyük önemini gösterdiler.

Kullanılan ışık kaynağına bağlı olarak farklı tipte konfokal mikroskopi vardır. Konfokal mikroskopi, ışık kaynağı olarak lazerle veya lazersiz yapılabilir. Tandem taramalı eş odaklı mikroskopta tipik olarak bir cıva lambası kullanılır. Tandem taramalı eş odaklı mikroskopla karşılaştırıldığında CLSM, belirli bir dalga boyuna ve yüksek aydınlatma gücüne sahip bir lazer ışını kullanır. Ayrıca floresan ve yansıtıcı CLSM arasında da bir ayrım yapılır. Güvenliği ve invaziv olmaması nedeniyle intravital yansıtıcı CLSM'nin kullanımı daha çok tercih edilir.

Yansıtıcı CLSM'nin temel prensibi, doku içindeki küçük bir noktayı aydınlatan bir nokta ışık kaynağının (lazer ışını) kullanılmasına ve ardından yansıyan ışığın optik olarak bağlanmış bir açıklık (dahil) yoluyla yakalanmasına dayanır (Şekil 1). . Yansıyan ışık, detektörden geçerek yalnızca odak içi ışığın dedektöre ulaşmasına neden olurken, odak dışı ışık saptırılır. Bu sayede örneklem içerisinde odakta olan tek bir plan belirlenir. Objektif merceğin sayısal açıklığı, dalga boyu ve açık açıklığın boyutu (dahil), yansıtıcı CLSM kullanılarak elde edilen görüntünün çözünürlüğünü belirler. Çeşitli dalga boylarındaki lazerler, yansıma eş odaklı mikroskopi için ışık kaynağı olarak kullanılabilir. Daha uzun yakın kızılötesi dalga boyları cildin daha derinlerine nüfuz eder ancak görünür spektrumdaki daha kısa dalga boylarına kıyasla daha düşük çözünürlük sağlar. Işık yansıması, doku içindeki kırılma indeksindeki lokal farklılıkların bir sonucu olarak ortaya çıkar. Bireysel organeller ve yapılar için bu, yakın çevreye kıyasla kırılma indeksindeki farklılıktan kaynaklanmaktadır. Melanozomlar, çevredeki epidermise kıyasla yüksek kırılma indekslerinden dolayı görünür (400–700 nm) ve yakın kızılötesi (700–1064 nm) spektrumlarda dalga boylarında güçlü yansıma sergiler. Bu nedenle, içeren hücreler

Pirinç. 1. Konfokal lazer tarama mikroskobunun çalışma şeması.

Bazal keratinositler ve melanositler gibi melanin parlak bir görüntü üretir.

Çeşitli üreticilerin eş odaklı taramalı lazer mikroskopları bulunmaktadır: Vivascope 1000, 1500, 2500 Lucid Inc., Rochester, NY; Optiscan F900, Optiscan Pty. Ltd., Notting Hill, VIC, Avustralya, vb. (Şekil 2). Bir Vivascope 1500 eş odaklı lazer mikroskobu kullanan Lucid Inc. Lazer tarama, 830 nm dalga boyunda, optik gücü 16 mW'ı geçmeyen, doku hasarına veya göze zarar vermeyen bir şekilde gerçekleştirilir. Objektif lens, yaklaşık 1 µm yanal çözünürlük ve 5 µm eksenel çözünürlük (kalınlık bölümü) ile 30x büyütme (NA 0,9) sağlar. Mikroskop suya batırılmış bir lens kullanır çünkü suyun kırılma indeksi epidermisinkine yakındır ve bu, dermisin daha derinlerini görüntülerken yüzeysel epidermal hücre katmanlarının neden olduğu küresel sapmayı en aza indirir. Tarama, saniyede 9 kare frekansta, 0,5x0,5 mm çerçeve boyutunda 4x4 mm XY düzlemlerinde gerçekleştirilir. Bu sistem, epidermis ve üst dermisi (papiller ve superior retiküler) görüntülemeye yetecek kadar 200 ila 400 µm derinlikte normal cildi görüntüleyebilir. 1000×1000 piksel çözünürlüğe sahip Lucid Stable View daldırma merceğinden taranan görüntü program tarafından işlenir

KLİNİK DERMATOLOJİ VE ZENEREOLOJİ 5, 2008

LİTERATÜR İNCELEMESİ

Pirinç. 2. Eş odaklı lazer tarama mikroskobu VivaScope 1500 “Lucid Inc”.

Vivascope Ver.7.0 ve maksimum 1280×1024 piksel çözünürlüğe sahip 19 inç renkli monitöre iletilir. Vivascope 1500 mikroskobunu kullanırken kontrast madde kullanımına gerek yoktur. Melanin ve keratin gibi cilt bileşenlerinin doğal kontrast ve kırılma indeksi farklılıkları nedeniyle görüntüleme mümkündür. Görüntü oynatımı sırasında artefakt oluşumunu azaltmak için özel bir cilt temas cihazı kullanılır. Arayüzde su veya jel bulunur. Bu cihaz, hastanın cildine yapışan ve mıknatısla donatılmış bir mikroskoba bağlanan metal bir halkadan oluşur. Bu cihaz, daldırma ortamına uyum sağlamak için içbükey bir şekle sahiptir.

CLSM yöntemi, geleneksel ışık mikroskobuna yakın bir çözünürlükle epidermis ve yüzeysel dermisin görüntülerinin elde edilmesini sağlar. Bu yöntemi kullanarak, yalnızca cilt uzantılarının görüntülerini elde etmek değil, aynı zamanda epidermisin farklı katmanlarındaki hücreleri, dermisin papiller katmanının liflerini ayırt etmek ve dermisin kılcal damarlarının durumunu değerlendirmek de mümkündür. Farklı hücrelerin morfolojisini inceleyebilir, hücresel ve hücre altı yapıların boyutunu, şeklini belirleyebilirsiniz. CLSM ile geleneksel histolojik inceleme arasındaki temel fark şudur:

Cilt katmanlarının elde edilen görüntüleri cilt yüzeyine (yüz yüze) yatay (paralel) olarak yönlendirilir ve bunlar aynı zamanda yarı tonlu görüntülerdir. Bu bakımdan elde edilen sonuçların yorumlanmasında ve intravital CLSM ile klasik biyopsi verileri kullanılarak elde edilen görüntülerin karşılaştırılmasında zorluklar ortaya çıkabilmektedir. Bir CLS mikroskobu kullanılarak cilt bölümlerinin ayrı ayrı görüntüleri elde edilebilir ve kan akışı gibi ciltte meydana gelen dinamik süreçleri göstermek için kısa filmler kaydedilebilir.

İntravital CLSM'nin temel avantajları, küçük bir doku parçasının eksizyonu (biyopsi), sabitleme, ince katmanlara (kesitlere) kesme, boyalarla boyama ve ardından gelen aşamaları içeren klasik patohistolojik incelemeye kıyasla inceleme sonuçlarının elde edilme hızıdır. ışık mikroskobu kullanılarak incelenmesi. CLSM, kesitlerin alınması ve boyanması sonucunda histolojik incelemede olduğu gibi çalışma sırasında dokuyu değiştirmez, böylece artefaktların görünümü en aza indirilir. Ayrıca işlem ağrısızdır, cilde zarar vermeden gerçekleşir ve iz bırakmaz. Yöntem, hastalıkların dinamiklerini değerlendirmenize olanak sağladığı gibi, gerçek zamanlı olarak (mikrografik cerrahi ile) ameliyat yapılmasını da mümkün kılar.

CLSM'nin dermatolojide kullanımına ilişkin ilk çalışmalar, sağlıklı cilt yapısının konfokal görüntülerinin elde edilmesi ve sonraki analizleri ile ilişkilendirilmiştir. M. Rajadhyaksha, S. Gonzalez ve ark. , M. Huzaira ve ark. , K.J. Busam ve ark. Epidermis, dermis, damar sistemi ve cilt uzantılarının (bireysel yağ bezleri, pilosebase foliküller, ter kanalları) ayrı ayrı katmanlarının konfokal görüntülerinin ayrıntılı açıklamaları sağlanmaktadır. Niteliksel özelliklere ek olarak, hücrelerin büyüklüğünün, epidermis katmanlarının yerinin derinliğinin ve kalınlığının morfometrik bir değerlendirmesi, papiller ve retiküler dermisin üst kısmındaki bireysel liflerin ve kollajen demetlerinin bir değerlendirmesi yapılır; kılcal damarların lümenlerinin çapı ve ayrıca kılcal damarların lümenlerindeki bireysel kan hücrelerinin boyutları verilir. K.J. Busam ve ark. , T. Yamashita ve ark. makalelerinde melanositlerin niteliksel bir değerlendirmesini veriyorlar, melanositlerin, pigmentli keratinositlerin, melanofajların morfolojik özelliklerini veriyorlar,

KLİNİK DERMATOLOJİ VE ZENEREOLOJİ 5, 2008

intravital CLSM ile elde edilen görüntülerde bu hücreleri ayırt edebilmektedir. Sunulan bir dizi çalışma, sağlıklı cilt yapısının topografik özelliklerini değerlendiriyor, ciltte yaşa bağlı değişiklikleri analiz ediyor ve güneşe maruz kalmanın sağlıklı insanların epidermis ve dermisi yapısı üzerindeki etkisini değerlendiriyor. Sağlıklı epidermis ve dermisin görüntülerinin nasıl göründüğünü anlamak, ciltteki patolojik değişiklikleri daha sonra tanımlamak için önemlidir.

Melanositik odaklarda bulunan büyük miktarda melanin, pigmente deri neoplazmalarını (nevi, melanom) intravital CLSM kullanılarak görüntüleme ve teşhis için ideal hale getirir. Dermatolojide kullanılan herhangi bir görüntüleme yönteminin amacı, tedavinin etkinliği buna bağlı olduğundan melanomun erken evrelerinde teşhis edilmesidir. K.J.'nin araştırma sonuçları Busam ve ark. , G. Pellacani ve ark. , R. Langley ve ark. , A. Gerger ve ark. CLSM yöntemi kullanılarak melanomun oldukça başarılı bir şekilde teşhis edilebileceğini gösterdi. Epidermis ve dermis içinde yıldız şeklinde olabilen pleomorfik parlak hücrelerin varlığı, büyük dallanma işlemlerine ve eksantrik olarak yerleştirilmiş büyük çekirdeklere sahip olmanın yanı sıra, belirsiz hücre sınırları ve parlak gri parçacıklar nedeniyle dikenli tabakanın arkitektoniğinin ihlaline sahiptir. (muhtemelen melanin) epidermiste dağılmış olup, melanomu teşhis etmenizi sağlar. Geleneksel histolojide kullanılan kriterlere dayalı olarak bu yöntemle intraepidermal melanom tanısı da konulabilmektedir. İntraepidermal melanomların konfokal görüntülemesi, üst granüler ve dikenli katmanlar dahil olmak üzere epidermisin tüm katmanlarındaki soliter birimlerde artan sayıda intradermal genişlemiş (atipik) melanosit ortaya çıkardı. Pigmentli olmayan melanomlarda da melanomun bazı belirtilerinin tespit edilebildiğini belirtmek gerekir. Ancak, çalışmaların yürütüldüğü küçük örneklem boyutlarının, melanom teşhisinde konfokal görüntüler için sunulan kriterlerin duyarlılığını ve özgüllüğünü henüz değerlendirmemize izin vermediğine dikkat edilmelidir.

K.J. Busam ve diğerleri, R. Langley ve diğerleri. merkezi konumlu çekirdeklere sahip, küçük monomorfik yuvarlak veya oval, yüksek oranda kırılan hücrelerin varlığı gibi konfokal görüntülerde melanositik nevus belirtilerini gösterir. Bu hücreler epidermis içinde, tipik olarak dermal papillayı çevreleyen dermoepidermal kavşakta ve nevüsün türüne bağlı olarak yüzeysel dermiste görülebilir.

Genellikle kan damarlarının yakınında bulunan birkaç hücreyi içeren yuvarlak kümeler (yuvalar) halinde gruplandırılırlar. Azgın, granüler, dikenli ve bazal katmanların mimarisi değişmeden kalır. Displastik nevüsler, dermoepidermal kavşakta keratinositler arasındaki etkileşimin sınırlarında lokalize bir azalma, epidermis içinde karakteristik parlak renkli granüllerin varlığı (muhtemelen melanin cisimcikleri) ve nevomelanositlerin boyutu ve şeklinde büyük çeşitlilik ile karakterize edilir. hala dallanmaktan ziyade daha yuvarlak veya oval olma eğilimindedirler. Yukarıdaki çalışmalar melanositik nevüs belirtilerinin geleneksel histolojik tabloyla iyi bir şekilde ilişkili olduğunu göstermektedir. Ancak az miktarda pigment içeren malign hücrelerin bu yöntemle doğru bir şekilde belirlenip belirlenemeyeceği henüz bilinmiyor. Bu konuyu açıklığa kavuşturmak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.

İntravital CLSM yöntemi, neoplastik odaklar açısından şüpheli atipik alanların belirlenmesini mümkün kılar. İncelenen literatürde aktinik keratoz çalışmasına yönelik çalışmalar D. Aghassi ve ark.'na aittir. , skuamöz hücreli karsinom çalışması - M. Horn ve ark. , bazal hücreli karsinom çalışması - M. Goldgrier ve ark. , A.L. Agero ve ark. , S. Nori ve diğerleri. , K. Sauermann ve ark. . CLSM, tedaviye başlamadan önce lezyonun sınırlarını belirlemeyi mümkün kılar; bu, malign lentigo melanom, bazı bazal hücreli karsinomlar veya klinik olarak zor olan tümörler dahil olmak üzere radyal büyüme paternine sahip tümörlerin sınırlarının değerlendirilmesinde yararlı olabilir. Sklerozan inatçı bazal hücreli karsinomlar gibi inceleyin. CLSM ile tespit edilen aktinik keratozun temel histopatolojik özellikleri arasında mimari bozukluk, pleomorfizm ile birlikte genişlemiş epidermal çekirdekler ve organize bozukluğa yol açan parakeratoz yer alır. Şu anda lazer penetrasyon derinliği, aktinik keratoz tanısı için CLSM'nin ana sınırlamasıdır. En yaygın insan derisi tümörü olan bazal hücreli karsinomun konfokal belirtileri, aynı eksen boyunca yönlendirilmiş karakteristik uzun çekirdeklere sahip uzun monomorfik tümör hücrelerinin adacıklarıdır. Bu eşit şekilde yönlendirilmiş hücre modeli, epidermisin kalınlığı boyunca uzanır ve dermal papillanın normal bal peteği benzeri modelini ve mimarisini kaybeder. Aşırı kıvrımlılık gösteren bol kan damarlarının yanı sıra ağırlıklı olarak mononükleer inflamatuar sızıntı, bazal hücreli karsinom hücreleriyle karışmış veya bunlara yakın konumlanmıştır.

KLİNİK DERMATOLOJİ VE ZENEREOLOJİ 5, 2008

LİTERATÜR İNCELEMESİ

S. Nori ve ark.'nın sonuçları. Geniş bir retrospektif çok merkezli çalışma, in vivo bazal hücreli karsinomun teşhisi için CLSM tarafından tespit edilen işaretlerin önemli ölçüde doğruluğunu gösterdi. Böylece CLSM, rezidüel veya klinik olarak şüpheli bazal hücreli karsinomun varlığının gerçek zamanlı olarak belirlenmesini mümkün kılar. Çeşitli çalışmalara göre CLSM, ameliyat sırasında eksizyonel örneklerin incelenmesi sırasında mikrografik cerrahi sırasında tümör sınırlarının hızlı bir şekilde değerlendirilmesine yardımcı olur. Deri tümörlerinin teşhisi için intravital CLSM'nin kullanımındaki sınırlayıcı faktörler arasında, yüzeysel dermisin altında doğru görüntülemeyi engelleyen sınırlı inceleme derinliği ve diğerlerinin yanı sıra inflamatuar hücrelerin kırma özelliklerinin varlığı yer almaktadır.

90'lı yıllarda bir dizi araştırmacının (S. Gonzalez ve diğerleri) derinin çeşitli inflamatuar durumlarını yansıtma konfokal mikroskobu kullanarak incelemek için gerçekleştirdiği çalışma, bu yöntemin yararlı bir teşhis aracı olarak büyük önemini ortaya çıkardı. Yöntemin en büyük avantajı, inflamatuar cilt hastalıklarındaki dinamik süreçlerin gerçek zamanlı değerlendirilmesine ve en önemlisi dermatoz tedavisinin etkinliğinin değerlendirilmesine olanak sağlamasıdır. İntravital CLSM kullanılarak sedef hastalığı, alerjik ve basit kontakt dermatit, folikülit, saçkıran, siğiller, herpes simpleks ve sistemik sklerozdaki inflamatuar değişiklikler değerlendirildi. Konfokal görüntülerde, psoriasis vulgaris'in sabit evredeki belirtileri olağan histolojik tabloya karşılık gelir ve parakeratoz, Munro mikroabseleri, akantoz, kılcal dilatasyon, papillomatozu içerir. Enflamatuar odağın sınırları açıkça görülebilir. CLSM kullanılarak spongiyoz, mikropartikül oluşumu, inflamatuar infiltrasyon ve bazı yerlerde epidermal nekroz gibi kontakt dermatitin tipik belirtileri gerçek zamanlı olarak görselleştirilir. Bu yöntemi kullanarak, basit ve alerjik dermatitin patohistolojik özellikleri ortaya konmuş ve aynı zamanda konfokal mikroskopinin, akut kontakt dermatitin ırksal (Negroid ve Kafkas ırkının temsilcilerinde) özelliklerini değerlendirmek için kullanılabileceği de gösterilmiştir. Konfokal lazer tarama mikroskobu, tırnak plakalarından ve deri parçalarından in vivo veya iv vitro olarak hiphal dallarının ve inflamatuar sızıntının hızlı, gerçek zamanlı tespitine olanak tanır. Konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenen folikülit kesin olarak teşhis edilebilir

intraepidermal püstüllerin, inflamatuar infiltrasyonun, spongiyozun ve kılcal damar genişlemesinin doğrudan gösterilmesiyle van. Konfokal görüntülerdeki siğiller, hiperkeratotik bir stratum korneum ve lezyonun içinde 20-40 μm ölçülerinde çok sayıda yüksek derecede kırılmaya neden olan yuvarlak yapıların varlığı ile karakterize edilir ve bu da hızlı ve kesin bir tanıya olanak tanır. Herpes cilt enfeksiyonları, keratinositler ve inflamatuar hücrelerle gevşek bir ilişki içinde olan pleomorfik balonlaşan keratinositlere ve çok çekirdekli dev hücrelere karşılık gelir.

Bu nedenle, intravital CLSM yöntemi, neoplastik lezyonlar, melanositik nevus, melanom dahil olmak üzere çeşitli dermatozlarda derideki patomorfolojik değişikliklerin in vivo değerlendirilmesine olanak tanır ve bu, bu aracın çeşitli dermatolojik hastalıkların tanısında şüphesiz yararlılığını doğrular. Yöntemin invazif olmayan doğası ve aynı lezyonlar üzerinde birden fazla çalışmanın tekrarlanma olasılığı göz önüne alındığında, CLSM'nin hastalıkların gelişimi sırasında deride meydana gelen dinamik değişiklikleri değerlendirmede ve devam eden tedavinin arka planına karşı daha yararlı olduğu görülmektedir. dermatozlar.

İntravital CLSM'nin bariz faydalı yönlerine rağmen, bu yöntemin kullanımında bazı sınırlamalar ve zorluklar da vardır. Mevcut teknik karmaşık ve pahalıdır ve bu nedenle araştırmacılar ve klinisyenler tarafından yaygın olarak kullanılamamaktadır. Ancak kurumlardaki ve endüstrideki birçok bilim insanı daha basit, daha ucuz tarama teknolojileri geliştiriyor. Vücudun ulaşılması zor bölgelerini incelerken hacimli birimlerin kullanılması sakıncalı olduğundan, mevcut mevcut cihazlarla karşılaştırıldığında daha fazla taşınabilir cihaz da geliştirilmektedir. İntravital CLSM'nin kullanımındaki sınırlayıcı bir faktör, yüzeysel dermisin altında doğru görüntülerin elde edilmesini engelleyen sınırlı inceleme derinliğidir. İntravital CLSM'nin yeteneklerini önemli ölçüde artıracağı için histolojik inceleme sırasında gördüklerimize benzer dikey yönelimli bölümler oluşturma çalışmaları devam ediyor. Görüntülerin yorumlanması büyük bir bilimsel sorundur

Yararlı klinik ve histolojik bilgileri vurgulamak için eş odaklı görüntüleri okuma, yorumlama ve analiz etme becerisi. Dünya çapında birçok ekip, konfokal görüntüleri karakterize etmek ve bunları histolojiyle ilişkilendirmek için ayrıntılı çalışmalar yürütüyor. Çeşitli dermatozların tanısında bu araştırma yönteminin duyarlılığının ve özgüllüğünün belirlenmesi önemli sorunlardan biri olmaya devam etmektedir.

KLİNİK DERMATOLOJİ VE ZENEREOLOJİ 5, 2008

EDEBİYAT

1. Abramovits W., Stevenson L.C. Dermatolojide değişen paradigmalar: noninvazif görüntüleme yöntemleri kullanarak cildi incelemenin yeni yolları. Dermatoloji Klinikleri 2003; 21: 353-358.

2. Minsky M. Mikroskopi aparatı. ABD Pat 1961; 467.

3. Minsky M. Konfokal tarama mikroskobunun icadına ilişkin anı. Tarama 1988; 10: 128-138.

4. Egger M.D., Petran M. Lekesiz beyin ve ganglion hücrelerini görüntülemek için yeni yansıyan ışık mikroskobu. Bilim 1967; 157: 305-307.

5. Davidovits P., Egger M.D. Kornea endotel hücrelerinin in vivo fotomikrografisi. Doğa 1973; 244: 366-367.

6. Amos W.B., White J.G. Konfokal lazer tarama mikroskobu biyolojik araştırmalara nasıl girdi? Hücre Biyolojisi 2003; 95: 335-342.

7. Brakenhoff G.J., Blom P., Barends P.Yüksek diyafram açıklığına sahip daldırma lensli eş odaklı taramalı ışık mikroskobu. J Mikroskopi 1979; 117:219-232.

8. Sheppard C.J.R., Wilson T. Küresel sapmanın taramalı optik mikroskopların görüntüleme özellikleri üzerindeki etkisi. Uygulamalı Optik 1979; 18:1058.

9. Hamilton D.K., Wilson T. Objektif lensle optik mikroskopi tarama. Tarama, Journal of Physics E: Scientific Instruments 1986; 19:52-54.

10. Pawley J.B. Biyolojik konfokal mikroskopinin el kitabı. New York: Plenum Press 1995.

11. Gonzalez S., Swindells K., Rajadhyaksha M., Torres A.Dermatolojide değişen paradigmalar: Klinik ve cerrahi dermatolojide konfokal mikroskopi. Clin Derm 2003; 21: 359-369.

12. Rajadhyaksha M., Grossman M., Esterowitz D. ve diğerleri.İnsan derisinin in vivo eş odaklı taramalı lazer mikroskobu: melanin güçlü kontrast sağlar. J Invest Dermatol 1995; 104: 946-952.

13. Rajadhyaksha M., Gonzalez S., Zavislan J.M. Oğlu R.R. ve ark.İnsan derisinin in vivo eş odaklı taramalı lazer mikroskobu II: enstrümantasyondaki ilerlemeler ve histolojiyle karşılaştırılması. J Invest Dermatol 1999; 113: 101-112.

14. Dokunun in vivo konfokal lazer mikroskobu görüntüleri. Lazer Odak Dünyası 1997; 33: 119-127.

15. Rajadhyaksha M., Zavislan J.M. Lekesiz dokunun in vivo konfokal yansıma mikroskobu. Retinoidler 1998; 14:26-30.

16. Gonzalez S., Rajadhyaksha M., Anderson R.R. Non-invazif Proliferatif bir cilt lezyonunun histolojik sınırının in vivo (gerçek zamanlı) görüntülenmesi. J Invest Dermatol 1998; 111: 538-539.

17. Gonzalez S., Gonzalez E., Beyaz W.M. ve ark.Alerjik kontakt dermatit: in vivo konfokal görüntülemenin rutin histolojiyle korelasyonu. J Am Acad Dermatol 1999; 40: 708-713.

18. Swindle L.D., Thomas S.G., Freeman M., Delaneyz P.M.Floresan kullanılarak gözlemlenen normal insan derisinin in vivo görünümü fiber optik eş odaklı

mikroskobik görüntüleme. J Invest Dermatol 2003; 121: 706-712.

19. Delaney P.M., Harris M.R., King R.G.Fiber optik eş odaklı görüntülemeyi kullanan yeni mikroskopi ve bunun in vivo yeraltı kan damarı görüntülemesine uygunluğu. Clin Exp Pharmacol Physiol 1993; 197:20.

20. Busam K.J., Charles C., Lohmann C.M. ve ark.Konfokal taramalı lazer mikroskobu ile intraepidermal malign melanomun in vivo tespiti. Melanom Araştırması 2002; 12: 349-355.

21. Aghassi D., Anderson R.R., González S.Aktinik keratozların in vivo konfokal lazer mikroskobik görüntülemesi: bir ön rapor. J Am Acad Dermatol 2000; 43: 42-48.

22. VivaScope 1500 Kullanım Kılavuzu Lucid Inc.

23. Corcuff P., Bertrand C., Leveque J.L.İnsan epidermisinin in vivo morfometrisi gerçek zamanlı konfokal, mikroskopi. Arch Dermatol Res 1993; 285: 475-481.

24. Meyer L.E., Otberg N., Richter H., Sterry W. ve diğerleri. Dermatolojide yeni umutlar: lif bazlı eş odaklı taramalı lazer mikroskobu. Lazer Fiziği 2006; 16:5: 758-764.

25. Serup J., Jemec G.B.E., Grove G.L. Non-invaziv el kitabı yöntemler ve cilt. 2. baskı. CRC Basını 2006; 32: 267-276.

26. Huzaira M., Rius F., Rajadhyaksha M., Anderson R.R. ve ark.İn vivo yansıma eş odaklı mikroskopi ile görüntülendiği şekliyle normal ciltteki topografik değişiklikler. J Invest Dermatol 2001; 116: 846-852.

27. Busam K.J., Charles C., Lee G., Halpern A.C.Melanositlerin, pigmentli keratinositlerin ve melanofajların in vivo morfolojik özellikleri

eş odaklı taramalı lazer mikroskobu. Mod Pathol 2001; 14:9:862-868.

28. Yamashita T., Kuwahara T., Gonzalez S., Takahashi M. Non-invazif melanin ve melanositlerin görselleştirilmesi yansıma modu konfokal mikroskopi. J Invest Dermatol 2005; 124: 235-240.

29. Sauermann K., Clemann S., Jaspers S., Gambichler T. ve diğerleri.İnsan cildinde yaşa bağlı değişiklikler, in vivo olarak konfokal lazer tarama mikroskobu ile histometrik ölçümlerle araştırıldı. Cilt Araştırmaları ve Teknolojisi 2002; 8: 52-56.

30. Sauermann K., Jaspers S., Koop U., Wenck H.Topikal olarak uygulanan C vitamini, yaşlı insan derisindeki dermal papilla yoğunluğunu arttırır. BMC Dermatoloji 2004; 4:13 doi:10.1186/1471-5945-4-13.

31. Pellacani G., Cesinaro A.M., Seidenari S. Yansıma modu pigmentli derinin konfokal mikroskobu lezyonların iyileşmesi melanom tanı özgüllüğünde. J Am Acad Dermatol 2005; 53: 979-985.

32. Langley R.G.B., Rajadhyaksha M., Dwyer P.J., Sober A.J. ve ark.İyi huylu ve kötü huylu melanositik deri lezyonlarının in vivo konfokal taramalı lazer mikroskobu. J Am Acad Dermatol 2001; 45: 365-376.

33. Gerger A., ​​​​Koller S., Kern T., Massone C. ve diğerleri.Melanositik deri tümörlerinde in vivo konfokal lazer tarama mikroskobunun tanısal uygulanabilirliği. J Invest Dermatol 2005; 124: 493-498.

34. Busam K.J., Hester K., Charles C. ve diğerleri.Klinik olarak amelanotik malign melanomun tespiti ve sınırlarının in vivo konfokal taramalı lazer mikroskobu ile değerlendirilmesi. Arch Dermatol 2001; 137: 923-929.

35. Horn M., Gerger A., ​​Koller S. ve ark. Konfokal lazer taramanın kullanımı İnvazif skuamöz hücreli karsinom için mikrocerrahide mikroskopi. İngiliz Dermatoloji Dergisi 2007; 156: 81-84.

36. Goldgrier M., Fox C.A., Zavislan J.M. ve ark.Noninvaziv görüntüleme, tedavi ve bazal hücreli karsinomun temizlendiğinin mikroskobik olarak doğrulanması. Dermatol Surg 2003; 29: 205-210.

37. Agero A.L.C., Busam K.J., Benvenuto-Andrade C. Pigmentli bazal hücreli karsinomun yansıma konfokal mikroskobu. J Am Acad Dermatol 2006; 54: 638-643.

38. Nori S., Rius-Dıaz F., Cuevas J. ve diğerleri. Duyarlılık ve özgüllük yansıma modu Bazal hücreli karsinomun in vivo tanısı için konfokal mikroskopi: çok merkezli bir çalışma. J Am Acad Dermatol 2004; 51: 923-930.

39. Sauermann K., Gambichler T., Wilmert M. ve diğerleri.Bazal hücreli karsinomun in vivo konfokal lazer tarama mikroskobu ile araştırılması. Cilt Araştırmaları ve Teknolojisi 2002; 8: 141-147.

40. Gonzalez S., Sackstein R., Anderson R.R., Rajadhyaksha M. Gerçek zamanlı Reflektans konfokal mikroskopi ile insan derisinde in vivo lökosit ticaretinin kanıtı. J Invest Dermatol 2001; 117:2: 384-386.

41. González S., Rajadhyaksha M., Rubinstein G., Anderson R.R.

Sedef hastalığının in vivo yansıma konfokal mikroskopisi ile karakterizasyonu. J Med 1999; 30: 337-356.

42. Astner S., Gonzalez E., Cheung A.C. ve ark. Non-invazif Alerjik ve irritan kontakt dermatit kinetiğinin değerlendirilmesi. J Invest Dermatol 2005; 124: 351-359.

43. Hicks S.P., Swindells K.J., Middelkamp-Hup M.A. ve ark. Tahriş edici kontakt dermatitin in vivo konfokal histopatolojisi ve cilt renginin etkisi (siyah vs beyaz). J Am Acad Dermatol 2003; 48: 727-734.

44. Gonzalez S., Rajadhyaksha M., Gonzalez-Serva A. ve diğerleri. Folikülitin in vivo konfokal yansıma görüntülemesi: rutin histoloji ile korelasyon. J Cutan Pathol 1999; 26: 201-205.

45. Markus R., Huzaira M., Anderson R.R., Gonzalez S.Daha iyi bir potasyum hidroksit preparatı mı? Konfokal mikroskopi ile tinea'nın in vivo tanısı. Arch Dermatol 2001; 137: 1076-1078.

46. Hongcharu W., Dwyer P., Gonzalez S., Anderson R.R.Onikomikozun in vivo konfokal mikroskopi ile doğrulanması. J Am Acad Dermatol 2000; 42: 214-216.

47. Goldgeier M., Fox C.A., Muhlbauer J.E.Konfokal taramalı lazer mikroskobu ile herpes virüsünün anında noninvazif tanısı. J Am Acad Dermatol 2002; 46: 783-785.

48. Sauermann K., Gambichler T., Jaspers S. ve diğerleri.Sistemik sklerozlu hastalarda in vivo konfokal lazer tarama mikroskobu ile elde edilen histometrik veriler. BMC Dermatoloji 2002; 2:8.

KLİNİK DERMATOLOJİ VE ZENEREOLOJİ 5, 2008

Margolin 389p.

Optik mikroskop, hem teknoloji hem de teknolojinin tüm başarılarının yanı sıra bilgi ve bilgisayar teknolojilerini de kullandı. Bu, mevcut ekipman ve kullanım yöntemlerinde önemli gelişmelere yol açtı ve bu da, özellikle eş odaklı mikroskopi olmak üzere yeni yöntemlerin ortaya çıkmasına yol açtı. Konfokal bir mikroskop, klasik bir optik mikroskoptan farklıdır; çünkü her anda bir nesnenin bir noktasının görüntüsü kaydedilir ve tarama yoluyla (örneği hareket ettirerek veya optik sistemi yeniden düzenleyerek) tam bir görüntü oluşturulur. Böylece, taramalı elektron mikroskobu prensibi, her bir noktadan gelen sinyalin istenildiği kadar kaydedilmesini ve işlenmesini mümkün kılan benzersiz bir biçimde uygulanmaktadır.

Klasik bir mikroskopta numunenin çeşitli noktalarından gelen ışık fotodetektöre girer. Konfokal mikroskopta, yalnızca bir noktadan gelen ışığın kaydedilmesi için, objektif merceğin arkasına, incelenen noktadan yayılan ışık diyaframdan geçerek kaydedilecek şekilde küçük bir diyafram yerleştirilir ve mercekten gelen ışık kalan noktalar, Şekil 2'de gösterildiği gibi esas olarak diyafram tarafından bloke edilir. 7.28.

Pirinç. 7.28. Eş odaklı optik mikroskopta ışın iletim şeması

Diğer bir özellik ise aydınlatıcının görüş alanında tekdüze bir aydınlatma yaratmaması, ışığı analiz edilen noktaya odaklamasıdır. Bu, numunenin arkasına ikinci bir odaklama sistemi yerleştirilerek sağlanabilir ancak bu, numunenin şeffaf olmasını gerektirir. Ayrıca objektif lensler genellikle pahalı olduğundan aydınlatma için ikinci bir odaklama sisteminin kullanılması pek tercih edilmez. Bir alternatif, hem gelen hem de yansıyan ışığın tek bir mercek tarafından odaklanmasını sağlayacak şekilde bir ışın ayırıcı kullanmaktır. Bu şema aynı zamanda ayarlamayı da kolaylaştırır.

Şimdi eş odaklı mikroskopi kullanıldığında kontrastın nasıl ve ne kadar niceliksel olarak değiştiğini ele alalım. Eş odaklı bir mikroskopta ışık mercekten iki kez geçtiğinden, nokta bulanıklığı işlevi (bundan sonra PSF olarak anılacaktır), bir fotonun kendi koordinatlarıyla bir noktaya çarpması veya bu noktadan bir fotonun algılanması bağımsız olasılıklarının ürünü olacaktır.

Çözünürlük için Rayleigh kriterini kullanırsak, eş odaklı bir mikroskopta çözünürlüğün arttığı, ancak önemli ölçüde olmadığı ortaya çıkar. Eş odaklı bir mikroskop için r çözünürlüğü için bir ifademiz vardır:

Geleneksel bir mikroskop için ise:

Bununla birlikte, eş odaklı bir mikroskobun temel avantajı Rayleigh kriteri anlamında çözünürlükte bir artış değil, kontrastta önemli bir artıştır. Özellikle odak düzlemindeki geleneksel bir PSF için birinci yan maksimumdaki genliğin merkezdeki genliğe oranı %2'dir ve eş odaklı bir mikroskop için bu oran %0,04 olacaktır. Bundan, örneğin parlak bir nesneninkinden 200 kat daha az yoğunluğa sahip loş bir nesnenin geleneksel bir mikroskopta tespit edilemeyeceği sonucu çıkar, ancak nesneler arasındaki mesafe Rayleigh kriteri tarafından belirlenen mesafeden önemli ölçüde daha büyük olabilir. . Aynı zamanda böyle bir nesnenin eş odaklı bir mikroskopta iyi kaydedilmesi gerekir.

Önemli bir parametre, ışınlama ve toplama merceklerinin odak düzlemindeki açıklıkların boyutudur. Nesne düzlemindeki açıklığın görüntüsü, ışığın fotodetektör tarafından hangi alanlardan algılanacağını belirler. Açıkçası, açıklık boyutunun azaltılması iletilen ışık miktarında bir azalmaya yol açar, gürültü seviyesini artırır ve sonuçta elde edilen kontrast avantajlarını ortadan kaldırabilir. Bu nedenle, en uygun açıklık boyutu seçimi ve makul bir uzlaşma sorusu ortaya çıkıyor.

Airy noktasından daha küçük delik boyutuna sahip bir açıklık, yalnızca yoğunluk kaybına neden olur ve çözünürlük üzerinde hiçbir etkisi olmaz. Tek noktalı Airy diyafram açıklığı, objektif merceğin çözme gücünün maksimum düzeyde kullanılmasına olanak tanır. Bununla birlikte, Airy noktasından yaklaşık 3 ila 5 kat daha büyük açıklık boyutuna sahip bir diyafram en uygun uzlaşma gibi görünmektedir. Burada tartışılan boyutun, nesne düzlemindeki görüntünün boyutunu ifade ettiği ve dolayısıyla açıklık deliğinin gerçek boyutunun merceğin büyütülmesine bağlı olduğu anlaşılmalıdır. Spesifik olarak, 100x lens kullanıldığında, 1 mm açıklığa sahip bir açıklık, nesne düzlemine 10 µm yarıçaplı bir daireye yansıtılacaktır.

Konfokal mikroskopi fikrinin gelişimi, gözlemlenen nesnelerin şeklini ve mekansal yapısını analiz etmek için daha hassas ve metrolojik açıdan titiz yöntemlere duyulan ihtiyaçtan kaynaklanan bir konfokal lazer tarama mikroskobunun (KJICM) geliştirilmesiydi. CLSM'nin ana fonksiyonel bağlantılarıyla birlikte şematik bir diyagramı Şekil 1'de gösterilmektedir. 7.29.

CLSM'nin ana özelliği, incelenen nesnenin yüksek çözünürlük ve düşük gürültü seviyesiyle katman katman görüntülenmesi olanağıdır. Bu, tutarlı bir kaynaktan gelen odaklanmış bir ışık huzmesi ile nesnenin adım adım taranmasıyla veya özel floresan problar ve ışık akısını sınırlamak için özel yöntemler kullanılarak sahnenin hareket ettirilmesiyle elde edilir.

Pirinç. 7.29. KJICM'nin blok şeması:

1 - tarama tablosu; 2 - örnek test; 3, 6 - lensler; 4 - tarama cihazı; 5 - ışın ayırıcı plaka; 7, 9 - iğne diyaframları; 8 - radyasyon alıcısı; 10 - lazer; 11 - Kontrol bloğu; 12 - bilgisayar; 13 - eksen tarama sürücüsü z.

CLSM'de boyutları mikroskop büyütmesi ve dalga boyu ile koordine edilen iğne deliği diyaframının kullanılması, çözünürlüğün %10'dan fazla arttırılmasını mümkün kılar. CLSM'nin çözünürlüğünün ve buna bağlı olarak ince yapıları analiz etme yeteneklerinin, bir numuneyi ince bir ışınla tarama koşulları altında geleneksel bir mikroskobun benzer yeteneklerini% 40'tan fazla aşamayacağı açıktır. KLCM'nin çözünürlüğü mikroskopi yöntemine ve aydınlatmaya bağlıdır. KLCM çözünürlüğü belirlendi hem optik sistem hem de elektronik yol bilgi işlem. Bu nedenle KLCM'nin tasarımında devrelerinin, optik sistemin çözünürlüğü, tarama adımı, dedektör özellikleri gibi parametrelerin koordine edilmesi, optimal işleme algoritmalarının ve uygun yazılımın seçilmesi gerekmektedir.

Genel olarak KLCM'nin alan derinliği açıklığa, dalga boyuna, ışık kaynaklarının tutarlılığına ve pin diyaframının boyutuna bağlıdır. İğne diyaframı, KLCM'yi diğer mikroskop türlerinden ayıran ana tasarım öğesidir. İğne diyaframlar, odak düzlemiyle çakışmayan veya odak düzleminde nesnenin analiz edilen öğesinin yanında bulunan noktalardan görüntü oluşum düzlemine giren ışığın maksimum veya tamamen filtrelenmesi için koşullar oluşturmak üzere tasarlanmıştır.

Optimum iğne diyafram çapının seçilmesi, gerekli cihaz özelliklerinin elde edilmesi açısından önemlidir. KJICM'nin yanal çözünürlüğünü ve alan derinliğini tahmin etmeye yönelik ilişkiler, iğne diyaframının parlak bir nokta olan küçük bir açıklığa sahip olduğu varsayımıyla elde edilir. Gerçekte, iğne diyaframının boyutu sınırlıdır ve cihazın enine çözünürlüğü ve eksen boyunca odak düzlemine göre kaydırılan numunenin aydınlatılmış elemanlarının parlaklığı buna bağlıdır. z, ve alan derinliği. Küçük iğne diyafram çaplarında ışık akısı düşük olur, bu da sinyal-gürültü oranını düşürür ve kontrastı azaltır. Daha büyük çaplarda, açıklık azaltılarak iğne diyaframının etkinliği azaltılır.

Konfokal mikroskopi, geleneksel klasik mikroskoplarla karşılaştırıldığında belirgin kontrasta sahip optik mikroskopi yöntemlerinden biridir. Bu yöntemin ayırt edici bir özelliği, arka planda saçılan ışığın akışını kesebilen bir diyaframın kullanılmasıdır.

Eş odaklı bir mikroskopta, nesnenin bir akımının görüntüsü zamanın her anında kaydedilir. Numunenin hareketi taranarak veya optik sistemin yeniden düzenlenmesiyle tam bir görüntü elde edilir. Objektif mercekten sonra incelenen noktanın yaydığı ışığın içinden geçip kaydedileceği, diğer noktalardan yayılan ışığın ise diyafram tarafından geciktirileceği şekilde küçük bir diyafram yerleştirilir.

Açıklanan araştırma yöntemi, çeşitli hücrelerin iç yapısını incelemeyi mümkün kılar. Onun yardımıyla bireysel molekülleri ve hücre yapılarını, mikroorganizmaları ve hücrelerde meydana gelen dinamik süreçleri tanımlayabilirsiniz.

Konfokal mikroskopi yönteminin açıklaması

Konfokal floresan mikroskobu sayesinde nesnelerin üç boyutlu mikron altı genişlemesini elde etmek mümkün hale geldi ve şeffaf numunelerin tahribatsız analizini yapma yeteneği de önemli ölçüde genişledi. Bu mikroskoplarda lazerlerin ışık kaynağı olarak kullanılması sayesinde çözünürlüklerinde artış sağlanır.

Ksenon veya cıva lambalarla karşılaştırıldığında lazerler, tek renkli olma ve yayılan ışık ışınına oldukça paralel olabilme yeteneklerine sahip oldukları için önemli avantajlara sahiptir. Lazer radyasyonunun bu özellikleri, optik sistemin daha verimli çalışmasını sağlamanın yanı sıra, parlama miktarını azaltır ve ışık ışınının odaklanma doğruluğunu arttırır.

İncelenen örnekte lazer görüş alanının tamamını aydınlatmaz, ancak belirli bir noktaya odaklanır. Konfokal diyafram, odak dışı floresanstan kurtulmanızı sağlar, diyaframın çapını değiştirirken, lazer ışınının odağına yakın optik katmanın kalınlığını doğru bir şekilde belirleyebilirsiniz. Bu özellik sayesinde eş odaklı mikroskopi, Z ekseni boyunca gelişmiş çözünürlük sağlar.

Konfokal mikroskopların donatıldığı özel programlar, bir dizi optik bölümden nesnelerin üç boyutlu görüntülerini oluşturmanıza ve bunları farklı bakış açılarından görüntülemenize olanak tanır.

Multispektral lazer taramalı eş odaklı mikroskobun kullanılması, hücrelerdeki çeşitli maddelerin kokolizasyonunu incelemeyi mümkün kılar. Multispektral mod, eş odaklı bir mikroskop kullanarak FISH çalışmaları yürütmenize olanak tanır.

Konfokal mikroskop kullanılarak gerçekleştirilen çalışmalara örnekler

Konfokal mikroskopi, çeşitli maddelerin çekirdekte, sitoplazmada veya diğer hücresel yapılarda birikme yeteneğinin incelenmesine yardımcı olur. Bu yetenekler sıklıkla kanserojenlerin, antitümör bileşiklerinin ve ilaçların etki mekanizmalarına ilişkin araştırmaların yürütülmesi sürecinde kullanılır ve ayrıca bunların etkili konsantrasyonlarının hesaplanmasını mümkün kılar.

İntrinsik floresans spektrumunun şeklinin yanı sıra yoğunluğunun öldürücü bir şekilde incelenmesi, iltihaplı ve normal hücrelerin tanınmasını mümkün kılar. Bu yöntem rahim ağzı kanseri teşhisinin erken aşamalarında kullanılır.

Çeşitli iç floresans türleri için tasarlanmış farklı filtrelerin uygun şekilde seçilmiş bir kombinasyonu, birden fazla bölümün yoğun emek gerektiren incelemesine gerek kalmadan elde edilebilir. Bu sayede kötü huylu doku yapıları hızlı ve doğru bir şekilde tespit edilip normal dokulardan ayırt edilebilmektedir.

Konfokal mikroskopi yöntemleri hidrobiyoloji ve embriyoloji, botanik ve zoolojide gametlerin yapısının yanı sıra organizmaların gelişimi ve oluşumunun incelenmesi sürecinde yaygın olarak kullanılmaktadır.

Modern dünyada eş odaklı lazer mikroskopları biyoloji, biyofizik, tıp, hücresel ve moleküler biyoloji alanlarında geniş uygulama alanı bulmuştur. Konfokal mikroskopi, günümüzde gözün korneasını incelemek için kullanılan benzersiz, temassız bir tekniktir. Mevcut hücresel değişikliklerin ve hücre dışı yapıların derecesini en doğru şekilde değerlendirmenize ve ayrıca bir bütün olarak korneaya olası hasar hakkında sonuçlar çıkarmanıza olanak tanır.

Lazer eş odaklı mikroskoplar yüksek çözünürlüğe sahiptir, bu nedenle floresan etiketli hücrelerin ve hatta bireysel genlerin yapısının incelenmesine olanak tanır. Biyolojik olarak aktif moleküllerin yanı sıra supramoleküler kompleksler için spesifik çok renkli floresan boyama için çeşitli teknolojilerin kullanılması, yalnızca bireysel hücrelerin değil, aynı zamanda tüm sistemlerin karmaşık işleyiş mekanizmalarının incelenmesini mümkün kılar. Bu teknoloji deneysel biyolojide ve tıpta yaygın olarak kullanılmaktadır.

Ekipman: eş odaklı mikroskoplar

Leica TCS SP8 gibi modern ultra hassas eş odaklı mikroskoplar, çeşitli çalışmalar yaparken en net ve güvenilir verileri elde etmenizi sağlar. Bu tür cihazlara olan yaygın ilgi, bilgisayar teknolojisinin ve lazer teknolojilerinin hızla gelişmesi nedeniyle geçen yüzyılın seksenli yıllarında ortaya çıktı.

Konfokal lazer tarama mikroskobu bir tür optik mikroskopidir. Özelliği, lazer ışınının X ve Y eksenleri boyunca belirli bir alana odaklanarak bir görüntü oluşturmasıdır. Yansıyan ışık ekranda raster şeklinde gösterilir. Görüntünün boyutu doğrudan modern elektroniklerin çözünürlüğüne ve taranan taramanın boyutuna bağlıdır.

Modern konfokal lazer tarama mikroskobu yöntemi kullanılarak oluşturulan ölçüm cihazları artık çeşitli alanlarda yaygınlaşmıştır. Geleneksel ışık mikroskobu ile karşılaştırıldığında, konfokal mikroskopi aşağıdaki avantajlara sahiptir:

• geliştirilmiş çözünürlük;
• yüksek görüntü kontrastı;
• yüksek derecede sinyal ayrımı ile multispektral çalışmalar yürütme yeteneği;
• üç boyutlu yeniden yapılandırma ile “optik kesitler” elde etme yeteneği;
• elde edilen görüntüler için dijital işleme yöntemlerinin kullanılması olasılığı;

Açıklanan ekipmanın dezavantajları şunları içerir:

• cihazı kurmanın karmaşıklığı;
• optik görüntünün eksikliği;
• cihazların yüksek maliyeti ve bakımlarının yüksek maliyeti.

Konfokal mikroskop, tüm sistemi kontrol etmek için özel bir bilgisayar kullanır. Görüntüleri kaydetmenize ve elde edilen verileri ayrıntılı olarak incelemenize olanak tanır. Ortaya çıkan görüntülerin yüksek kalitede işlenmesi genellikle oldukça fazla bilgi işlem gücü gerektirir, bu nedenle bilgisayarın oldukça büyük bir RAM'e sahip olması gerekir. Daha fazla bilgi depolamak için büyük disk belleği de gereklidir. Görüntüleri aktarmak için böyle bir bilgisayarın bir USB bağlantı noktasına veya CD/DVDRW'ye sahip olması gerekir. Bilgisayar ayrıca küresel İnternet'e veya yerel ağa bağlanabilme özelliğine de sahiptir.

Bu tür bilgisayarlara yüklenen yazılım temel olabilir. Ekipmanla birlikte gelir ve tüm sistemi yönetmenize ve temel işlevlerini izlemenize olanak tanır. Ayrıca bu bilgisayarlar için ek olarak sipariş edilen uygulama görevleri paketleri özel olarak geliştirilmiştir. Birçok konfokal mikroskop modelinde, çalışmalarını uzaktan yapılandırmanıza olanak tanıyan özel bir kontrol paneli bulunur.

Açıklanan cihazları rutin laboratuvar ziyaretleri sırasında kurun. Konfokal mikroskopların çalışması sırasındaki en önemli prosedür titreşim kontrolüdür. Bu tür amaçlar için titreşim seviyesini ölçen özel bir cihaz kullanılır. Kontrol prosedürü, bir ayna kullanarak LSCM'nin eksenel çözünürlüğünü ölçme prosedürüne benzer.

Konfokal mikroskopi hızla gelişiyor. Tanınmış imalat şirketleri, lazer uyarma ışınını ve lüminesansı etkin bir şekilde ayırmayı mümkün kılan en yeni konfokal mikroskop modellerini piyasaya sunmaktadır. Bu tür cihazlardaki ışın ayırıcı bir bilgisayar tarafından kontrol edilir. Gerekirse spektral özellikleri birkaç lazer çizgisine hızla ayarlanabilir.

Mikrobiyolojide eş odaklı mikroskoplar

Konfokal mikroskop, hücrelerin ayrıntılı incelenmesi için biyolojide de vazgeçilmezdir. Bugün bu konuyla ilgili çok sayıda farklı bilimsel makale yayınlanmaktadır. Çoğu zaman, konfokal mikroskoplar hücrelerin yapısını ve organellerini incelemek için kullanılır. Hücredeki maddeler arasında neden-sonuç ilişkisi olup olmadığını anlamak amacıyla hücredeki kolokalizasyon da incelenmektedir.

Proteinlerin konfokal mikroskoplarla incelenmesi sürecinde, bunlar öncelikle farklı florokromlara sahip antikorlarla etiketlenir. Sıradan bir klasik mikroskop kullanarak yan yana mı yoksa alt üste mi olduklarını ayırt etmek oldukça zordur, ancak konfokal mikroskop bunu sorunsuz bir şekilde yapmanızı sağlar. Bir dizi optik kesite ilişkin veriler bilgisayar belleğine kaydedilir ve böylece nesnenin hacimsel olarak yeniden yapılandırılması gerçekleştirilir ve üç boyutlu görüntüsü de elde edilir.

Ayrıca, eş odaklı mikroskopların yardımıyla, canlı hücrelerde meydana gelen dinamik süreçler, örneğin kalsiyum iyonlarının veya diğer maddelerin hücre zarlarından hareketi incelenir. Konfokal mikroskoplar ayrıca, ışınlama bölgesindeki florokromun fotokimyasal ayrışmasının iyonizasyonunu ve ayrıca moleküllerden daha sonra ayrılmasını kullanarak biyoorganik moleküllerin hareketliliğini incelemek için kullanılır. Bu tür moleküller, alıcının absorpsiyon spektrumu ile örtüşen, donörün emisyon spektrumuna sahip olan iki florokromla etiketlenir. Böylece enerji, vericiden alıcıya kısa mesafelerde ve enerji seviyeleri arasındaki rezonans sonucunda aktarılır. Bundan sonra alıcı, spektrumun görünür bölgesinde enerji yayar ve bu daha sonra eş odaklı bir mikroskop kullanılarak kaydedilir.

Konfokal mikroskopinin gelişimi devam ediyor. Bu ekipmanın üreticileri her yıl piyasaya daha modern, işlevsel ve geliştirilmiş mikroskoplar sunarak bilim adamlarının çeşitli alanlarda yeni faydalı keşifler yapmasına olanak tanıyor. Eş odaklı mikroskoplarla donatılmış bilgisayarlar için tasarlanmış yazılımlar da geliştirilmektedir. Moleküler ve hücresel düzeyde araştırma yapmayı mümkün kılan en karmaşık görevleri uygulamanıza olanak tanır. Bugün, işlevsel özellikleri ve teknik yetenekleri açısından geleneksel mikroskopları önemli ölçüde aştıkları için eş odaklı mikroskopların geleceğin olduğunu güvenle söyleyebiliriz. Oldukça geniş bir konfokal optik ekipman yelpazesi arasından, her kullanıcı kendisi için doğru mikroskobu seçebilecek ve bu da onun araştırmasını aktif olarak geliştirmesine olanak tanıyacak.

Hikaye

1950'lerde biyologların, kalın doku kesitlerinde florokrom etiketli nesneleri gözlemlemenin kontrastını artırmaya ihtiyaçları vardı. Bu sorunu çözmek için ABD'de profesör olan Marvin Minsky, floresans mikroskopları için eş odaklı bir şema kullanılmasını önerdi. 1961'de Minsky bu plan için bir patent aldı.

Çalışma prensibi

Konfokal mikroskop, geleneksel mikroskopla aynı çözünürlüğe sahiptir ve kırınım sınırıyla sınırlıdır.

burada radyasyon dalga boyu, merceğin sayısal açıklığı, örnek ile mercek arasındaki ortamın kırılma indisi, merceğin "yakaladığı" açının yarısıdır. Görünür aralıkta çözünürlük ~ 250 nm'dir (NA=1.45, n=1.51).Ancak son yıllarda örneklerin floresansının doğrusal olmayan özelliklerini kullanan mikroskop tasarımları başarıyla geliştirilmiştir. Bu durumda kırınım sınırından önemli ölçüde daha düşük ve ~ 3-10 nm olan bir çözünürlük elde edilir.

Konfokal mikroskop, geleneksel bir mikroskopla bulanık görünen bir numunenin net görüntüsünü üretir. Bu, numunenin derinliklerinden gelen arka plan ışığının açıklıkla, yani mikroskop merceğinin odak düzlemine düşmeyen ışığın kesilmesiyle sağlanır. Sonuç, geleneksel bir optik mikroskoptan daha iyi kontrasta sahip bir görüntüdür.

Görüntü iki boyutlu (2D) bir resimdir.

Ayrıca bakınız

Biyolojinin diğer mikroskoplara göre avantajları

Biyolojik nesnelerin kırılma indisi neredeyse camınkiyle aynıdır, dolayısıyla bu nesneleri bir cam slaytın yüzeyinde gözlemlemek geleneksel bir mikroskopta çok zordur. Yüksek kontrasta sahip bir konfokal mikroskop, iki paha biçilmez yetenek sağlar: dokuyu fizyolojik aktivite durumunda hücresel düzeyde incelemenize ve ayrıca çalışmanın sonuçlarını (yani hücresel aktiviteyi) dört boyutta değerlendirmenize olanak tanır - yükseklik, genişlik, derinlik ve zaman.

Notlar

Bağlantılar

• Moleküler İfadeler: Lazer Taramalı Konfokal Mikroskopi
• Nikon'un MikroskopiU. Konfokal mikroskopiye kapsamlı giriş.
• Emory'nin Fizik Bölümü. Konfokal mikroskopi ve floresansa giriş.
• Science Creative Quarterly'nin eş odaklı mikroskopiye genel bakış - yüksek çözünürlüklü görüntüler de mevcuttur.
• Programlanabilir Dizi Mikroskobu - Eş Odaklı Mikroskop Özellikleri.

Wikimedia Vakfı. 2010.

Diğer sözlüklerde “Eş odaklı mikroskop” un ne olduğunu görün:

Bu terimin başka anlamları da vardır, bkz. Mikroskop (anlamlar). Mikroskop, 1876 ... Vikipedi

Atomik kuvvet mikroskobu Atomik kuvvet mikroskobu (AFM atomik kuvvet mikroskobu), yüksek çözünürlüklü bir taramalı prob mikroskobudur. Tasarımdan alınan bir çözünürlükle yüzey topoğrafyasını belirlemek için kullanılır... Vikipedi

İnsan gözüyle ayırt edilemeyen nesnelerin mikroskopla incelenmesi yöntemlerinin genel adı. Daha fazla ayrıntı için bkz. (bkz. MİKROSKOP). Fiziksel ansiklopedik sözlük. M.: Sovyet Ansiklopedisi. Genel yayın yönetmeni A. M. Prokhorov. 1983... Fiziksel ansiklopedi

- (İngilizce: nitrojen boşluk merkezi) veya elmastaki nitrojenle ikame edilmiş boşluk, elmastaki birçok nokta kusurundan biridir. Kusur, elmas kristal kafesinin yapısında bir atom çıkarıldığında meydana gelen bir bozukluktur... ... Vikipedi

Wikipedia'da bu soyadı taşıyan diğer kişiler hakkında makaleler var, bkz. Minsky. Wikipedia'da bu soyadı taşıyan diğer kişiler hakkında makaleler var, bkz. Minsky. Marvin Lee Minsky İngilizce Marvin Lee Minsky ... Vikipedi

Minsky, Marvin Lee Yapay zeka alanında Amerikalı bilim adamı Doğum tarihi: 9 Ağustos 1927 (19270809) ... Wikipedia

Minsky, Marvin Lee Yapay zeka alanında Amerikalı bilim adamı Doğum tarihi: 9 Ağustos 1927 (19270809) ... Wikipedia

Minsky, Marvin Lee Yapay zeka alanında Amerikalı bilim adamı Doğum tarihi: 9 Ağustos 1927 (19270809) ... Wikipedia

Lee Yapay zeka alanında Amerikalı bilim adamı Doğum tarihi: 9 Ağustos 1927 (19270809) ... Wikipedia

Kitabın

• Canlı bir hücrenin konfokal mikroskopisi ve ultramikroskopisi, Georgy Mihayloviç Svishchev. Konfokal mikroskop, bir tür taramalı ışık mikroskobudur. Kalın nesneleri incelerken, geleneksel mikroskopların ürettiği arka plansız görüntüler üretir...